Achievements
多年來，國際市場對肝素的需求一直十分旺盛。因肝素是從動物內(nèi)臟中提取加工而得的，產(chǎn)量受到一定限制，時常滿足不了市場需求。自20世紀90年代后期開始，全球市場肝素需求大幅增加，我國肝素生產(chǎn)和出口連年均以較大幅度上升，出口量和出口金額呈快速增長態(tài)勢。中國已成為世界上首屈一指的肝素原料藥出口大國。
肝素抗凝血藥產(chǎn)品價格：注射用精品8~10美元/ mega，口服用為7~8 美元/ mega，具有可觀的經(jīng)濟效益。
肝素酶具有許多重要的醫(yī)藥用途，包括制備低分子量肝素，體外循環(huán)中肝素的消除，肝素精確結(jié)構(gòu)的確定，制備抗腫瘤藥物，抑制新血管生成及堿性成纖維細胞生長因子介導血管內(nèi)皮細胞的增殖等等。其中最重要的是制備低分子量肝素（LMWH）。采用酶法制備LMWH反應條件溫和，與其他方法（物理分離法和化學裂解法）相比較，具有收率高，對環(huán)境友好，易實現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化等優(yōu)點。如果能夠使用固定化肝素酶降解肝素，得到的產(chǎn)品和肝素酶易于分離，生產(chǎn)方便，而且酶可反復使用，還可進一步節(jié)約成本。因此有關(guān)肝素酶產(chǎn)品的生產(chǎn)倍受人們關(guān)注。
在降解反應中，MBP-hepA融合酶的最佳反應溫度為30 ℃，但MBP-hepA的熱穩(wěn)定性較差，在30 ℃下的半衰期僅為10 min，因此若在較高溫度下反應由于酶的失活會導致反應很快結(jié)束。實驗表明，該融合酶在15 ℃卻能表現(xiàn)出極好的穩(wěn)定性，保存58 h后還能夠保持100％的酶活，故反應溫度應選擇15 ℃。
在該酶解反應中，低分子肝素產(chǎn)品的平均分子量與各寡糖含量有著密切的聯(lián)系，反應時間越長，則產(chǎn)品降解越充分，得到的低分子量肝素平均分子量越小。利用MBP-hepA融合酶，通過控制反應時間，可得到理想的低分子量肝素（LMWH，Mw<3500）和超低分子量肝素（uLMWH，Mw<2500）。超濾膜酶反應體系實驗結(jié)果表明，10mL MBP-HepA（2184IU/L）酶液與200mL含肝素鈉25g/L的底物溶液反應，充分反應后反應混合物經(jīng)過截留分子量5000的超濾膜包（Millpore公司）后得到的濾過液中低分子量肝素產(chǎn)物的重均分子量僅為1375，分布系數(shù)僅為1.2，重量收率為80％左右，已經(jīng)達到超低分子量肝素的要求。所以在酶解過程中MBP-hepA融合酶可以幾乎不損耗活力，穩(wěn)定性很好，利用膜酶反應器可以循環(huán)使用。
目前，酶降解法中的肝素酶產(chǎn)品來源主要是肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum）中肝素酶I的分離純化。但此法所得到的肝素酶產(chǎn)量低、純化困難，造成酶的成本非常昂貴，也極大地限制了酶法制備低分子肝素的發(fā)展。而利用重組菌株生產(chǎn)肝素酶I是一條極有前景的途徑，但通常的表達體產(chǎn)生的肝素酶I容易形成包涵體，無法直接利用。
清華大學在多年來一直致力于開發(fā)高效的肝素酶生產(chǎn)技術(shù)，解決肝素酶應用的成本問題的研究，從一株肝素黃桿菌中克隆得到肝素酶I的基因，利用融合蛋白技術(shù)構(gòu)建了高效生產(chǎn)可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，實現(xiàn)了可溶肝素酶I的生產(chǎn)，獲得了很高的酶活。研究表明，該重組可溶肝素酶I能和商品肝素酶一樣有效地降解肝素, 制備出理想的LMWH。通過控制酶解反應條件，可得到平均分子量在5000~6000的低分子量肝素寡糖。另外，利用膜生物反應器通過控制酶反應時間和酶量，還能夠制備出目前國際上備受關(guān)注超低分子量肝素（平均分子量2000~3000左右）。所以該融合表達法是一種具有廣泛應用前景的低成本生產(chǎn)肝素酶I的方法。該法得到的重組肝素酶I只需進行一步親和層析就能達到95%的純化效果；同時利用融合蛋白的親和吸附能力容易實現(xiàn)肝素酶I的定向固定化；融合酶的穩(wěn)定性高，使酶的反復使用成為可能，從而提高酶反應效率，降低酶的使用成本和低分子量肝素的生產(chǎn)成本。實驗結(jié)果表明，該融合酶搖瓶培養(yǎng)的酶活可以達到16000IU/L，5L發(fā)酵罐生產(chǎn)酶活達到了20000IU/L以上。由于該重組肝素酶I的生產(chǎn)、分離純化和使用成本可以大幅度降低，因此利用該融合蛋白生產(chǎn)具有理想平均分子量且分子量分布范圍窄的低分子量肝素的方法蘊含巨大的工業(yè)應用價值。根據(jù)前期的研究結(jié)果，估算融合肝素酶的生產(chǎn)成本大約為50元/100IU。
酶降解法目前已經(jīng)被用作分析肝素的結(jié)構(gòu)和制備低分子肝素（LMWH）/超低分子量肝素（uLMWH）。該法普遍采用的酶是從肝素黃桿菌中分離純化出肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種，它們能夠特異性地裂解肝素鏈上具有特殊結(jié)構(gòu)的不同序列，從而產(chǎn)生不同的寡糖片段。肝素酶作用的基本過程是使己糖胺和糖醛酸之間的鍵斷裂，在非還原末端生成4,5-不飽和艾杜糖醛酸，該還原末端在230~235 nm處有明顯吸收，而此吸收值又與降解產(chǎn)物中的肝素分子量有一定關(guān)系，因此可以通過測量230 nm處的吸收度來控制產(chǎn)品質(zhì)量。低分子量肝素產(chǎn)品的分子量主要是通過反應時間、酶的用量、反應液的pH 值等因素來調(diào)整。另外如果使用固定化肝素酶降解肝素，產(chǎn)品和肝素酶易于分離，生產(chǎn)方便，酶可反復使用，可節(jié)約成本。固定化酶和超濾法聯(lián)用可精確的控制產(chǎn)物的分子量，并實現(xiàn)生產(chǎn)的自動化。
本技術(shù)生產(chǎn)的MBP-hepA融合酶可以滿足上述的要求，高效地用于低分子肝素（LMWH）/超低分子量肝素（uLMWH）的制備。同時設(shè)計了一套超濾膜酶反應體系。實驗結(jié)果表明，通過控制酶反應時間和酶量，可以制備出平均分子量在5000~6000并符合歐洲藥典要求（抗Xa活性不得低于70 IU/mg，抗Xa與抗IIa活性比值不得低于1.5）的低分子量肝素產(chǎn)品和目前國際上備受關(guān)注超低分子量肝素（平均分子量2000~3000左右）。該項目已申請專利5項，并獲得2007年第十七屆全國發(fā)明展覽會銀獎。
商談。
