Achievements
多年來(lái),，國(guó)際市場(chǎng)對(duì)肝素的需求一直十分旺盛,。因肝素是從動(dòng)物內(nèi)臟中提取加工而得的,，產(chǎn)量受到一定限制,，時(shí)常滿足不了市場(chǎng)需求,。自20世紀(jì)90年代后期開(kāi)始,，全球市場(chǎng)肝素需求大幅增加,，我國(guó)肝素生產(chǎn)和出口連年均以較大幅度上升，出口量和出口金額呈快速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),。中國(guó)已成為世界上首屈一指的肝素原料藥出口大國(guó),。
肝素抗凝血藥產(chǎn)品價(jià)格：注射用精品8~10美元/ mega，口服用為7~8 美元/ mega,，具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益,。
肝素酶具有許多重要的醫(yī)藥用途,，包括制備低分子量肝素,，體外循環(huán)中肝素的消除，肝素精確結(jié)構(gòu)的確定,，制備抗腫瘤藥物,，抑制新血管生成及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖等等。其中最重要的是制備低分子量肝素（LMWH）,。采用酶法制備LMWH反應(yīng)條件溫和,，與其他方法（物理分離法和化學(xué)裂解法）相比較，具有收率高,，對(duì)環(huán)境友好,，易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化等優(yōu)點(diǎn)。如果能夠使用固定化肝素酶降解肝素,，得到的產(chǎn)品和肝素酶易于分離,，生產(chǎn)方便，而且酶可反復(fù)使用,，還可進(jìn)一步節(jié)約成本,。因此有關(guān)肝素酶產(chǎn)品的生產(chǎn)倍受人們關(guān)注,。
在降解反應(yīng)中，MBP-hepA融合酶的最佳反應(yīng)溫度為30 ℃,，但MBP-hepA的熱穩(wěn)定性較差,，在30 ℃下的半衰期僅為10 min，因此若在較高溫度下反應(yīng)由于酶的失活會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)很快結(jié)束,。實(shí)驗(yàn)表明,，該融合酶在15 ℃卻能表現(xiàn)出極好的穩(wěn)定性，保存58 h后還能夠保持100％的酶活,，故反應(yīng)溫度應(yīng)選擇15 ℃,。
在該酶解反應(yīng)中，低分子肝素產(chǎn)品的平均分子量與各寡糖含量有著密切的聯(lián)系,，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng),，則產(chǎn)品降解越充分，得到的低分子量肝素平均分子量越小,。利用MBP-hepA融合酶,，通過(guò)控制反應(yīng)時(shí)間，可得到理想的低分子量肝素（LMWH,，Mw<3500）和超低分子量肝素（uLMWH,，Mw<2500）。超濾膜酶反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，10mL MBP-HepA（2184IU/L）酶液與200mL含肝素鈉25g/L的底物溶液反應(yīng),，充分反應(yīng)后反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)截留分子量5000的超濾膜包（Millpore公司）后得到的濾過(guò)液中低分子量肝素產(chǎn)物的重均分子量?jī)H為1375，分布系數(shù)僅為1.2,，重量收率為80％左右,，已經(jīng)達(dá)到超低分子量肝素的要求。所以在酶解過(guò)程中MBP-hepA融合酶可以幾乎不損耗活力,，穩(wěn)定性很好,，利用膜酶反應(yīng)器可以循環(huán)使用。
目前,，酶降解法中的肝素酶產(chǎn)品來(lái)源主要是肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum）中肝素酶I的分離純化,。但此法所得到的肝素酶產(chǎn)量低、純化困難,，造成酶的成本非常昂貴,，也極大地限制了酶法制備低分子肝素的發(fā)展。而利用重組菌株生產(chǎn)肝素酶I是一條極有前景的途徑,，但通常的表達(dá)體產(chǎn)生的肝素酶I容易形成包涵體,，無(wú)法直接利用。
清華大學(xué)在多年來(lái)一直致力于開(kāi)發(fā)高效的肝素酶生產(chǎn)技術(shù)，解決肝素酶應(yīng)用的成本問(wèn)題的研究,，從一株肝素黃桿菌中克隆得到肝素酶I的基因,，利用融合蛋白技術(shù)構(gòu)建了高效生產(chǎn)可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，實(shí)現(xiàn)了可溶肝素酶I的生產(chǎn),，獲得了很高的酶活,。研究表明，該重組可溶肝素酶I能和商品肝素酶一樣有效地降解肝素, 制備出理想的LMWH,。通過(guò)控制酶解反應(yīng)條件,，可得到平均分子量在5000~6000的低分子量肝素寡糖。另外,，利用膜生物反應(yīng)器通過(guò)控制酶反應(yīng)時(shí)間和酶量,，還能夠制備出目前國(guó)際上備受關(guān)注超低分子量肝素（平均分子量2000~3000左右）。所以該融合表達(dá)法是一種具有廣泛應(yīng)用前景的低成本生產(chǎn)肝素酶I的方法,。該法得到的重組肝素酶I只需進(jìn)行一步親和層析就能達(dá)到95%的純化效果,；同時(shí)利用融合蛋白的親和吸附能力容易實(shí)現(xiàn)肝素酶I的定向固定化；融合酶的穩(wěn)定性高,，使酶的反復(fù)使用成為可能,，從而提高酶反應(yīng)效率，降低酶的使用成本和低分子量肝素的生產(chǎn)成本,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，該融合酶搖瓶培養(yǎng)的酶活可以達(dá)到16000IU/L，5L發(fā)酵罐生產(chǎn)酶活達(dá)到了20000IU/L以上,。由于該重組肝素酶I的生產(chǎn),、分離純化和使用成本可以大幅度降低，因此利用該融合蛋白生產(chǎn)具有理想平均分子量且分子量分布范圍窄的低分子量肝素的方法蘊(yùn)含巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值,。根據(jù)前期的研究結(jié)果,，估算融合肝素酶的生產(chǎn)成本大約為50元/100IU。
酶降解法目前已經(jīng)被用作分析肝素的結(jié)構(gòu)和制備低分子肝素（LMWH）/超低分子量肝素（uLMWH）,。該法普遍采用的酶是從肝素黃桿菌中分離純化出肝素酶Ⅰ,、Ⅱ,、Ⅲ三種,，它們能夠特異性地裂解肝素鏈上具有特殊結(jié)構(gòu)的不同序列，從而產(chǎn)生不同的寡糖片段,。肝素酶作用的基本過(guò)程是使己糖胺和糖醛酸之間的鍵斷裂,，在非還原末端生成4,5-不飽和艾杜糖醛酸，該還原末端在230~235 nm處有明顯吸收,，而此吸收值又與降解產(chǎn)物中的肝素分子量有一定關(guān)系,，因此可以通過(guò)測(cè)量230 nm處的吸收度來(lái)控制產(chǎn)品質(zhì)量。低分子量肝素產(chǎn)品的分子量主要是通過(guò)反應(yīng)時(shí)間,、酶的用量,、反應(yīng)液的pH 值等因素來(lái)調(diào)整,。另外如果使用固定化肝素酶降解肝素，產(chǎn)品和肝素酶易于分離,，生產(chǎn)方便,，酶可反復(fù)使用，可節(jié)約成本,。固定化酶和超濾法聯(lián)用可精確的控制產(chǎn)物的分子量,，并實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的自動(dòng)化。
本技術(shù)生產(chǎn)的MBP-hepA融合酶可以滿足上述的要求,，高效地用于低分子肝素（LMWH）/超低分子量肝素（uLMWH）的制備,。同時(shí)設(shè)計(jì)了一套超濾膜酶反應(yīng)體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，通過(guò)控制酶反應(yīng)時(shí)間和酶量,，可以制備出平均分子量在5000~6000并符合歐洲藥典要求（抗Xa活性不得低于70 IU/mg，抗Xa與抗IIa活性比值不得低于1.5）的低分子量肝素產(chǎn)品和目前國(guó)際上備受關(guān)注超低分子量肝素（平均分子量2000~3000左右）,。該項(xiàng)目已申請(qǐng)專利5項(xiàng),，并獲得2007年第十七屆全國(guó)發(fā)明展覽會(huì)銀獎(jiǎng)。
商談,。
